1. 引言：无菌工艺验证的重要性
无菌工艺验证是制药生产中最严格、风险最高的环节之一。与终端灭菌不同，无菌工艺涉及在受控条件下组装无菌组件和产品，以保持无菌状态。技术、环境或设备的任何缺陷都可能导致微生物污染，从而危及患者安全和产品完整性。
包括美国食品药品监督管理局 (FDA)、欧洲药品管理局 (EMA)和世界卫生组织 (WHO)在内的全球监管机构都要求对无菌工艺进行严格的验证和控制。这包括模拟运行（培养基灌装）、洁净室认证、人员培训、气流可视化以及无菌保证方案验证。新修订的欧盟 GMP 附件 1 更加强调污染控制策略 (CCS) 以及基于风险的无菌系统持续验证。
本文涵盖无菌工艺验证的方方面面，从环境确认到工艺模拟、操作员验证以及微生物控制。无论您是在准备FDA批准前检查 (PAI)，还是在修订场地主文件，本指南都能提供切实可行的见解和清晰的法规要求。
2. 监管框架和全球指南
监管机构要求企业在生产无菌产品时遵循严格的验证规范。概述这些要求的关键文件包括：
· FDA 行业指南 – 无菌工艺生产的无菌药品（2004 年）：涵盖洁净室设计、培养基灌装、EM 和穿戴等内容的基础性美国指南。
· EU GMP 附件 1（2022 年修订版）：介绍了污染控制策略 (CCS)、目视检查和 HVAC 分区期望。
· WHO TRS 961 附件 6：为欠发达设施中的无菌产品生产提供指导。
· ISO 13408系列：医疗保健产品无菌加工标准。
“经验证的无菌工艺”指不止一次成功的培养基灌装——它需要可重复、可再现的无菌保证，并以风险评估、操作员资质认证、强大的暖通空调 (HVAC) 验证以及可捕捉偏差并防止再次发生的质量体系为支撑。文档必须易于审计、可追溯，并能证明其生命周期控制。
3. 无菌处理与终端灭菌
清晰地理解无菌灭菌与终端灭菌的区别有助于确定工艺设计的合理性。终端灭菌是指将最终产品在其最终容器中进行灭菌（例如，通过高压灭菌或伽马射线辐照），以确保微生物被彻底杀灭，而不受中间污染风险的影响。
然而，无菌工艺要求在整个过程中保持无菌状态，而无需最终的灭菌步骤。这包括产品的无菌过滤、无菌成分制备以及在A级单向气流下的灌装。因此，无菌工艺的风险较高，需要更频繁的重新验证、操作员培训和持续监控。
制药公司必须记录选择无菌而非终端灭菌的理由，尤其对于生物制剂或热敏性注射剂。污染控制策略必须涵盖所有步骤——从洁净室认证到穿戴防护服、灌装机设计以及接触部件的灭菌。
4.洁净室分类及环境控制
无菌操作必须在经过分类的洁净室中进行，并严格控制颗粒物和微生物污染。洁净室区域通常根据 ISO 14644 标准进行分类，并与欧盟 GMP 区域保持一致：
· A 级 (ISO 5)：无菌活动的关键区域，例如灌装、塞碗或开口容器。
· B 级（ISO 7/8）： A 级环境的背景区域 - 用于准备和支持活动。
· C 级和 D 级：用于不太重要的操作，例如组件清洗、配方或初始材料处理。
必须验证环境参数，例如非活性颗粒数量、活性空气/表面污染、温度、湿度和压差，并将其保持在预先定义的警报/行动限值内。例如，pharmaregulatory.in建议，ISO 5 标准下，运行中每立方米颗粒数量不应超过 3,520 个≥0.5 µm 的颗粒。
验证包括暖通空调 (HVAC) 认证（参见PharmaSOP.in）、气流可视化（烟雾研究）和环境监测测绘。验收标准基于最坏负载和人员存在场景。
5. 培养基填充研究（过程模拟）
培养基灌装是无菌工艺验证的基石。这些灌装过程模拟了使用微生物生长培养基（例如胰蛋白酶大豆肉汤）代替实际产品的整个灌装过程。其目的是评估无菌技术、环境和设备是否能够共同防止污染。
介质填充的最佳实践包括：
· 至少连续 3 次成功模拟运行
· 使用最大线路速度和最坏情况干预
· 包括所有班次、操作员和产品容器类型
· 将灌装好的产品在 20–25°C 下培养 14 天，然后在 30–35°C 下培养
· 接受标准：≤5,000 单位，阳性率为 0；5,000-10,000 单位，阳性率为 ≤1
任何不合格均需进行全面的根本原因调查，并可能需要重新验证。培养基灌装必须每年或在重大设备/工艺变更后重新进行。培养基灌装方案和偏差处理模板可从PharmaSOP.in获取。
6. 穿戴防护服的资格和操作员监控
操作员是无菌区域内最大的污染风险源。因此，个人防护服必须经过认证、监控并定期重新验证。典型的方案包括：
· 初始穿戴资格：包括理论培训、穿戴观察和表面接触板评估。
· 常规监测：手术期间和手术后手套印记和手术服接触板取样。
· 定期重新认证：每年或每两年一次的重新认证，包括知识评估和穿戴模拟。
例如，超过警戒限值的操作员（例如，手套上菌落形成单位 (CFU) 超过 1）可能需要重新培训并限制访问。欧盟附件 1 建议所有 A/B 级操作员均应接受基于模拟的验证，尤其是在涉及无菌干预时。
来自穿戴资格的趋势数据必须整合到整体污染控制策略 (CCS) 中，并与培养基填充结果和环境监测结果相链接。
7. 无菌生产线和设备确认
所有涉及无菌处理的设备均须经过设计品质保证 (DQ)、质量保证 (IQ)、操作品质保证 (OQ) 和过程品质保证 (PQ) 认证，以验证其是否支持无菌维护。这包括：
· 灌装和加塞机
· 冻干机和高压灭菌器
· 限制进入屏障系统（RABS）
· 隔离器和转移舱口
· 无菌过滤装置
认证过程中的关键测试包括 HEPA 过滤器的完整性、单向气流测绘和模拟干预。例如，灌装线必须保持 0.45 米/秒 ±20% 的层流均匀性，A 级和 B 级区域之间的压差必须≥10–15
Pa。
必须进行无菌保持时间研究（针对设备灭菌后），并且清洁验证必须解决无菌生产线上的产品和微生物残留物的去除。
8. 无菌保证和微生物控制
无菌工艺中的无菌保证水平 (SAL) 反映了非无菌单元在工艺过程中存活的概率。与终端灭菌以 10 -6的 SAL 为目标不同，无菌工艺的目标是通过工艺完整性、培养基灌装和微生物监测来达到 SAL。
关键的微生物控制包括：
· 生物负载限值：必须在除菌过滤前进行测试。肠外给药的生物负载限值通常为NMT 10 CFU/100 mL。
· 过滤器完整性测试： 0.22 µm 过滤器使用前和使用后的泡点或压力保持测试。
· 环境微生物学：空气、表面和人员数量趋势与警报/行动限值相符。
· 消毒剂功效研究：验证对原位驻留菌群的有效性。
· 最终产品无菌测试：根据 USP 或 Ph. Eur.
2.6.1 在经过验证的洁净室条件下进行。
无菌测试中的偏差必须触发偏差调查、趋势审查，并可能进行培养基灌装重新认证。洁净室恢复研究、孢子控制评估以及快速微生物学方法 (RMM) 的整合正在成为先进无菌设施的最佳实践。
9. 文档、风险评估和生命周期重新验证
无菌验证的各个环节都必须有可追溯的文档支持，并通过风险评估进行论证。欧盟附件1规定的污染控制策略 (CCS) 必须与设备设计、人员控制、暖通空调 (HVAC) 验证、环境监测 (EM) 程序以及清洁/消毒程序相一致。
生命周期验证意味着：
· 初始资格：介质填充、HVAC PQ、操作员资格、防护服和气流研究
· 持续监控：趋势 EM、媒体填充、偏差、审计结果
· 定期重新认证：年度介质填充、每两年一次的 HVAC PQ、变更后重新验证
· 变更控制和 CAPA 集成：记录并审查所有偏差、故障和改进
例如，更换灌装泵、防护服材料或 B 级区域布局必须触发变更控制审查、可能的风险重新评估和有针对性的重新认证。
数据完整性原则 (ALCOA+) 适用于所有无菌验证记录。确保所有涉及电子显微镜 (EM) 或设备确认的电子系统均已设置审计追踪、访问控制和备份协议。
10. 结论
无菌工艺验证并非一次性任务，而是一个持续改进的程序，必须适应产品、人员、技术和法规要求的变化。随着FDA、EMA和WHO对附件1合规性的审查日益严格，企业不仅必须主动验证培养基灌装，还必须验证无菌链的每个环节。
从洁净室分区和穿戴技术到微生物监测和过滤器测试，每个环节都必须经过验证、趋势分析，并整合到污染控制策略中。根本原因分析、基于风险的验证和数字化文档如今已成为GMP规范的必备规范。
掌握无菌验证的制药公司将减少批次不合格，避免警告信，并维护患者对无菌产品安全的信任。
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